gwLee's study

종오형님의 부탁으로 Websat 셋팅에 대해서 짧지만 긴 블로깅이 시작됩니다.

기본 디렉토리 구조
http://hostname/account/websat/ 로 접속 가능한 상태에서 설명 시작하겠습니다.
/home/account/public_html/websat -> HOME
/var/www/html/account (심볼릭 링크)

대부분 그냥 압축 파일 설정 풀면 다 되던데..;;
이녀석은 꽤나 까다롭습니다. 아직도 제대로 실행이 안되니깐요.

vi HOME/js/wesat.js
....
xmlHttp.open("POST", "/cgi-local/websat/sat.php", true);
>> xmlHttp.open("POST", "cgi-local/sat.php", true);
....
var textoLoading = "<br/><br/><div class=\"labels\" style=\"text
-align: center; font-weight: bold;\">Finding repeats... <br/><img src=\"/websat/imagens/loading.gif\" /></div>";
>> var textoLoading = "<br/><br/><div class=\"labels\" style=\"text-align: center; font-weight: bold;\">Finding repeats... <br/><img src=\"imagens/loading.gif\" /></div>";
....
xmlHttp.open("POST", "/cgi-local/websat/sat.php", true);
>> xmlHttp.open("POST", "cgi-local/sat.php", true);
....
xmlHttp.open("POST", "/cgi-local/websat/primer.php", true);
>> xmlHttp.open("POST", "cgi-local/primer.php", true);
....
window.open("/cgi-local/websat/export.php", "WEBSAT_EXPORT
_POPUP", "");
>> window.open("cgi-local/export.php", "WEBSAT_EXPORT_POPUP", "");
[END]

vi HOME/cgi-local/utils.php
#!/usr/local/bin/php >> 삭제
....
$DIRETORIO_CGI = "/DOC_ROOT/cgi-local/websat/";
>> $DIRETORIO_CGI = "HOME/cgi-local/";
$DIRETORIO_BASE = "/DOC_ROOT/websat/";
>> $DIRETORIO_CGI = "HOME/";
$DIRETORIO_TROLL = "/TROLL_DIRECTORY/troll";
>> $DIRETORIO_TROLL = "/home/account/public_html/troll-0.2-linux-ia32/";
$DIRETORIO_MOTIFS = "/TROLL_DIRECTORY/troll";
>> $DIRETORIO_MOTIFS = "/home/account/public_html/troll-0.2-linux-ia32/";
$DIRETORIO_SEQ_UPLOAD = "/DOC_ROOT/websat/tmp/";
>> $DIRETORIO_SEQ_UPLOAD = "HOME/tmp/";
....
[END]

 

vi HOME/cgi-local/sat.php
#!/usr/local/bin/php >> 삭제
....
$motifFileName  = "motifs" . $pMotifLen . ".dat";
>> $motifFileName  = "motifs.dat";
....
[END]

vi HOME/cgi-local/export.php
#!/usr/local/bin/php >> 삭제
....
[END]

vi HOME/cgi-local/primer.php
#!/usr/local/bin/php >> 삭제
....
[END]

메일에 적은 것과 같이 추가적인 프로그램이 필요합니다요

troll과 primer3
구글님께 검색해보시면 나오고요..
troll의 경우 제 경우에는 lib Error가 나서
libstdc++-libc6.2-2.so.3 설치해 주었습니다.
primer3는 make 해주시고 실행 파일을 troll 폴더로
옮기시면 별도의 파일 수정 없어도 됩니다.

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Blast와 함께 보편적으로 사용되는 Hmmer에 대한 설명서
hmmbuild/ hmmcalibrate/ hmmsearch에 대해서 설명
-물론 제가 사용하는 옵션에 대해서만 blast만큼 많지 않음. default로 사용해도 문제가 없으니깐~ 문제를 모르는것일 수도.. ㅎㅎ


hmmbuild: hmm matrix 만들어 줌
hmmbuild [-options] <hmmfile output> <alignment file>

-F 기존에 동일 이름의 hmm파일이 있으면 삭제하고 새로 만듬. 이 옵션 설정 안해주면 hmmbuild 아예 실행안됨.


-f/ -g/ -s algorithm styles을 설정하는 옵션 이번에 사용하면서 이런 옵션을 처음 봤습니다. 왠지 hmm 멋져보이는 이유는.. ㅋ


--amino/ --nucleic 강제로 alignment file이 어떤 서열인지 알려주는 것입니다.


-sequence weighting strategies
- model construction strategies
위의 무엇인가 고급스러운 것을 최대한 안건드리면 사용하는게
제 생활신조입니다. default인 이유는 그런 이유가 있을 것이다 라는.. ㅋ
개인적으로 잘 아시는 분만 선택해서 사용하시면 됩니다.
사용방법은 옵션을 그냥 적어주시면 됩니다.

hmmcalibrate: 만들어진 hmm matrix를 보정 시켜줌 
hmmcalibrate [-options] <hmmfile>
--cpu: 프로그램 수행에 사용할 cpu 갯수 설정, 멀티 코어의 경우 가능. 단, 컴파일 및 바이너리 파일을 받을때 cpu옵션이 on 되어 있는 것을 받아야 사용 가능

--seed: hmmcalibrate를 몇번 수행할것인지 설정 하는 옵션 인듯.

본인의 hmmcalibrate 사용 예

hmmsearch: 만들어진 hmm 파일을 이용해서 유사한 서열을 찾음.
hmmsearch [-options] <hmmfile> <sequence file or database>

-A <n>: 상위 n개 까지만 출력
-E <x>: blast의 e-value cutoff와 같은 것
-T/ -Z옵션도 안좋은 값을 짤라내기 위한 옵션

--cpu : 프로그램 수행에 사용할 cpu 갯수 설정, 멀티 코어의 경우 가능. 단, 컴파일 및 바이너리 파일을 받을때 cpu옵션이 on 되어 있는 것을 받아야 사용 가능

 --domE <x> / --domT <x>
위의 -T/ -Z의 옵션과 같이 도메인에서 필터링 하는 옵션인듯. 사용 안해봤음. ^^
<sequence file or database>는 fasta format 파일이면 사용 가능함.

본인이 으레 쓰는 방법임. hmmsearch 결과는 '>'로 빼주면 됨.

 

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NCBI에서 제공되는 formatdb에 대한 메뉴얼
blast-2.2.18을 기준으로 작성합니다. 현재 2.2.20이 나와있죠??
아마 옵션은 거의 동일할것입니다.
-제가 자주 쓰는 옵션 중심으로 설명합니다.

-t  데이터베이스에 Title걸어주는 옵션. 사용안해봐서 모르겠음. Maybe 일반적으로 input_filename에 대해서 결과 파일이 나오는데 결과파일의 이름을 바꿔주는 옵션일 수도.

-i 데이터베이스 만들려고 하는 파일


-l formatdb시 생설될 로그 파일 이름 설정 옵션 설정 안해도 formatdb.log라는 파일 생성

-p input 파일 타입 설정. 기본적으로 protein 서열들이 들어올것으로 설정되어 있음.


-o Parse 옵션. NCBI에서 받은 정형화된 서열 format이 아니라면 F가 상책
임의의 fasta 파일의 경우 -o T 해주면 formatdb 생성 안됨.


input파일이 ASN.1 형식의 파일일 경우 사용되는 옵션
 -a  Input file is database in ASN.1 format (otherwise FASTA is expected)
 -b  ASN.1 database in binary mode
지금까지 한번도 사용안해봄. 대충 감은 오시죠???

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NCBI에서 제공되는 Blastpgp에 대한 메뉴얼
blast-2.2.18을 기준으로 작성합니다. 현재 2.2.20이 나와있죠??
아마 옵션은 거의 동일할것입니다.
제가 많이 사용하는 것을 중심으로 설명합니다.

-d blast를 돌리기 위한 데이터베이스 선택하는 옵션

-i 검색해보고 싶은 서열(들) 입니다. Query 파일은 fasta format으로 되어있어야 함.

-e Expectation value를 정해줘서 설정된 값보다 크면 결과에 포함시키지 않는 옵션. 일반적으로 blastn의 경우 1e-06/1e-12, blastp의 경우 1e-03/1e-06으로 설정하고 상황마다 조정하면서 사용.

-m 결과 파일을 저장할때의 format 결정 옵션. 일반적으로 로컬에서 blast를 돌리시려는 분들은 대량의 서열을 분석하기 위함이니, -m 8이 결과 파일을 분석하기 용이함,

-o Blast 결과 파일 설정하는 옵션

-M blast를 실행시킬때 Matrix를 사용하게 하는 옵션. 서열과 서열을 비교하면서 weight를 주어서 peptide 서열을 검색할때 사용됨. 기본값은 BLOSUM62.
Matrix는 /your_blast_folder/data/ 밑에 있음.

-a CPU가 1개 이상일때 blast 수행시 하나 이상의 cpu를 사용하게 하는 옵션

-j Blastpgp의 반복 옵션. Blast를 한번만 수행하는 것이 아니라 검색한 결과를
기반으로 처음보다 더 좋은 결과를 이끌어 내게끔 검색 횟수를 반복시켜 주는것.

-p PHI-Blast를 위한 프로그램 옵션

-k blast 수행시 패턴을 이용해서 blast를 수행하게 한다.

-file format은 prosite에서 제공되는 형식임.

보기

-B Alignment 파일 사용 옵션. PSI-Blast에서 PSSM 만들때 유저가 관여할 수 있게 해주는것 같음.

Alignment file format (clustalw/clustalx의 aln 형식의 파일이면 사용 가능)

보기

참고 사이트 rcc.uga.edu

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NCBI에서 제공되는 Blastall에 대한 메뉴얼
blast-2.2.18을 기준으로 작성합니다. 현재 2.2.20이 나와있죠??
아마 옵션은 거의 동일할것입니다.
제가 많이 사용하는 것을 중심으로 설명합니다.

-p 5개의 기본 blast 프로그램중 하나를 선택하는 옵션

-d blast를 돌리기 위한 데이터베이스 선택하는 옵션

-i 검색해보고 싶은 서열(들) 입니다. Query 파일은 fasta format으로 되어있어야 함.

-e Expectation value를 정해줘서 설정된 값보다 크면 결과에 포함시키지 않는 옵션. 일반적으로 blastn의 경우 1e-06/1e-12, blastp의 경우 1e-03/1e-06으로 설정하고 상황마다 조정하면서 사용.

-m 결과 파일을 저장할때의 format 결정 옵션. 일반적으로 로컬에서 blast를 돌리시려는 분들은 대량의 서열을 분석하기 위함이니, -m 8이 결과 파일을 분석하기 용이함,


-o Blast 결과 파일 설정하는 옵션


-M blast를 실행시킬때 Matrix를 사용하게 하는 옵션. 서열과 서열을 비교하면서 weight를 주어서 peptide 서열을 검색할때 사용됨. 기본값은 BLOSUM62.
Matrix는 /your_blast_folder/data/ 밑에 있음.

-a CPU가 1개 이상일때 blast 수행시 하나 이상의 cpu를 사용하게 하는 옵션

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요즘 생명공학을 공부하면서 Blast 툴을 모르는 사람은
아마도 거의 없을 것이다. (분명 몰라도 상관없는 분들 계시리라 믿는다. ^^)

blastn : search a nucleotide DB,          using a nucleotide query
blastp : search proein DB,                using a proein query

blastx : search protein DB,               using a translated nucleotide query
tblastx: search translated nucleotide DB, using a translated nucleotide query
tblastn: search translated nucleotide DB, using a protein query

blastn과 blastp의 경우 이름에 나와있다시피
크게 헷갈릴일이 없다. ^^
query와 db모두 같으니 말이다.

그러나 blastx/tblastn/tblastx의 경우 query와 db가 동일하지 않아서
많은 경우 헷갈리고 결국 구글님께 문의를 하게된다.

blast 앞에 t가 붙는 것은 search translated nucleotide DB
blast 뒤에 x가 붙는 것은 using a translated nucleotide query
로 외워주시면 다른 정보는 유추 가능하므로 헷갈리지 않겠지요.. ^^

사실.. 구글님께 때마다 여쭤보는게 사실 가장 편하고 빠르고 정확하긴 합니다. ㅋㅋ

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사용예:
./clustalw2 -INFILE=input_file(경로를 포함해도 가능) -ALIGN -TREE -TYPE=PROTEIN -OUTFILE=output_file(경로를 포함해도 가능) 
-OUTPUT=output_format -MATRIX=GONNET -GAPOPEN=10.00 -GAPEXT=0.20
-MAXDIV=30 -GAPDIST=4

파라미터와 파라미터값 사이에 공백있으면 인식못함
-INFILE= input_file (X)
-INFILE=input_file  (O)

-TREE: 꼭필요없음, Tree를 그릴경우 옵션으로 기입.
-TREE는 항상 dnd 확장자로 저장된

 

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Transeq

Function: Translate nucleic acid sequence

Usage:
# transeq input_files output_files

그외에 옵션사용시
frame지정할 수 있음. Forward/Reverse 혹은 1,2,3/-1,-2,-3
6은  All six frame대하여 수행
# transeq input_files output_files -frame 6

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DNA club 실행 후 DNA (or Protein) 서열을 붙이 모습

일반적으로 서열 작업을 할 때 쓰는 기능 [Convert]

[Reverse] 버튼을 클릭하면 새로운 창에 원래 서열에 대해서 역순의 서열이 만들어 진다.

[Reverse+Complement] 버튼을 누르면 역순에 상보적인 서열이 새창에 만들어진다.

서열을 변환시키는 것을 숙지하였으면 다음에 Primer를 만드는 방법에 대해서 보자.
[PCRPrimers]라는 기능을 사용하여 제작할 수 있다.

[PCRPrimers]라는 기능 및에 Start Primer Selection 이라는 기능이 제공되고 있지만,
여기에서는 하나씩 만드는 방법을 다루도록 하겠다.

[PCRPrimer] 밑에 [Evaluate a Primer] 기능은 임의로 선택한 서열이
primer로 사용 가능한지 판단할 수 있는 몇몇 변수들을 보여준다.

18-21/24-27bp 정도를 선택하여 primer로 적합한지 확인 할것.
몇가지를 고려 해주어서 확인.
Dimer/Hairpin Formation 갯수는 적을수록
End Stability 는 High
GC content는 너무 눞지 않게
Tm값은 일정하게 (Forword가 55도이면 Reverse도 55도)
하는것이 좋다.

다음은 primer 제작에 고려되어야 할 사항들을 요약한 것이다.

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Using BLASTClust to Make Non-redundant Sequence Sets

BLASTClustis a program within the standalone BLAST package used to cluster eitherprotein or nucleotide sequences. The program begins with pairwisematches and places a sequence in a cluster if the sequence matches atleast one sequence already in the cluster. In the case of proteins, theblastp algorithm is used to compute the pairwise matches; in the caseof nucleotide sequences, the Megablast algorithm is used.

Inthe simplest case, BLASTClust takes as input a file containingcatenated FASTA-format sequences, each with a unique identifier at thestart of the definition line. BLASTClust formats the input sequence toproduce a temporary BLAST database, performs the clustering, andremoves the database at completion. Hence, there is no need to runformatdb in advance to use BLASTClust. The output of BLASTClustconsists of a file, one cluster to a line, of sequence identifiersseparated by spaces. The clusters are sorted from the largest clusterto the smallest.

BLASTClust accepts a number ofparameters that can be used to control the stringency of clusteringincluding thresholds for score density, percent identity, and alignmentlength. The BLASTClust program has a number of applications, thesimplest of which is to create a non-redundant set of sequences from asource database. As an example, one might have a library of a fewthousand short nucleotide sequence reads and wish to replace these witha non-redundant set. To produce the non-redundant set, one might use:

blastclust -i infile -o outfile -p F -L .9 -b T -S 95

Thesequences in "infile" will be clustered and the results will be writtento "outfile". The input sequences are identified as nucleotide (-p F);"-p T", or protein, is the default. To register a pairwise match twosequences will need to be 95% identical (-S 95) over an area covering90% of the length (-L .9) of each sequence (-b T) . Using "-b F"instead of "-b T" would enforce the alignment length threshold on onlyone member of a sequence pair. The parameter "S", used here to specifythe percent identity, can also be used to specify, instead, a "scoredensity." The latter is equivalent to the BLAST score divided by thealignment length. If "S" is given as a number between 0 and 3, it isinterpreted as a score density threshold; otherwise it is interpretedas a percent identity threshold.

To create a stringent non-redundant protein sequence set, use the following command line:

blastclust -i infile -o outfile -p T -L 1 -b T -S 100

Inthis case, only sequences which are identical will be clusteredtogether. The “blastclust.txt” file in the standalone BLAST packagedetails the full range of BLASTClust parameters.

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